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ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

點擊次數(shù):13046   發(fā)布時間:2018/12/4 10:49:03

    在elisa試劑盒實驗中,標(biāo)準(zhǔn)曲線做的好與壞會直接影響到實驗的結(jié)果,甚至是關(guān)系到實驗的成敗,那么究竟如何繪制或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線呢?
一、選擇什么方程去擬合
用于免疫檢測的所謂“標(biāo)準(zhǔn)曲線”其實稱為擬合曲線比較合適。免疫檢測時標(biāo)準(zhǔn)點(可以是倍比稀釋的,也可以不是)濃度如果和相應(yīng)的吸光度(OD)值如果能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是zui理想的了,這時可以通過EXELL等方便的獲得擬合曲線,進(jìn)而推算出樣品的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情況,標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是"S"型的曲線關(guān)系,這時就不能用直線擬合的方式了,而對擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。
關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式,直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合,但都只適用于曲線的一部分,有的適用于前半段,有的適用于后半段,有的適用于中間一段,而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的適用性。當(dāng)然,如果用于定量,還是在中間一段較好。這些方法雖然沒有一種方法可以通用,但也都可以用。關(guān)鍵在于你的標(biāo)準(zhǔn)曲線做到了S形的哪一部分,你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部分。在S曲線的低濃度部分可以用乘冪方程很好的擬合,中低濃度部分可以用直線方程,中間部分可用對數(shù)方程,而中后段可用四參數(shù)。
目前上zui流行的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合”,用這種擬合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系,從而進(jìn)一步比較正確的獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。
其實,在一個長的區(qū)間內(nèi),Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。但并不是說它就是萬能的。事實上不僅是ELISA試劑盒,其它很多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲線,也都可以用Logistic曲線擬合。但建模型是一回事,而用它來定量是另一回事。如果用來定量,S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的,而兩端的平坦部分計算誤差會大,有時甚至?xí)艽蟆?
二、做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意
2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度,即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi),包括上限和下限。而對于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線,盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度zui陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒炓蟛煌兴儎,但一般來說,相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98,對于有些實驗,至少要0.99甚至是0.999.
5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個點,但至少要保證有5個點。
1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出來的,所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事,否則后面的實驗結(jié)果無從談起。
3、zui好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度,這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。
4、用ELISA試劑盒檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品時,應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行,以減少高濃度對低濃度的影響,提高準(zhǔn)確性。
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