摘要 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不論對酶分子本身作用機(jī)制的研究以及其他研究，越來越需要純度很高的酶制劑，這就要求我們熟悉酶提純的一般操作及酶的提純及活力測定等重要的生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)，本次實(shí)驗(yàn)主要是提取啤酒酵母中的蔗糖酶并測定其Km。在試驗(yàn)過程中用乙醇分級沉淀法，DEAE-Cellulose柱層析，分子篩層析提取純化蔗糖酶。在實(shí)驗(yàn)過程中，雖然我們很努力,但由于我們對實(shí)驗(yàn)的程序不熟悉，因此在實(shí)驗(yàn)的一些過程中有一些明顯的操作失誤，使得實(shí)驗(yàn)的*后測定結(jié)果與理論值有一定出入。
關(guān)鍵詞 蔗糖酶 透析 Km
前言
生物體內(nèi)所發(fā)生的一切化學(xué)反應(yīng)，幾乎都是在專一性酶的催化下進(jìn)行的，因此酶的研究對了解生命活動的規(guī)律以及生命本質(zhì)的闡述具有十分重要的意義。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不論對酶分子本身作用機(jī)制的研究以及其他研究，越來越需要純度高的酶制劑。由于酶本身也是蛋白質(zhì)，因此酶分離提存的方法大體上與蛋白質(zhì)純化方法相同，一般來說，沒有一種固定的方法，而往往根據(jù)你所要分離提純酶的取材以及酶本身的物理﹑化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)來確定分離提純方法。各種酶的純化通常有五個階段：①材料的選擇與預(yù)處理；②細(xì)胞破碎；③抽提；④純化；⑤濃縮﹑干燥及保存。
酶分離純化成功與否的重要標(biāo)志，一是要有較高的收率，二是達(dá)到所要求的純度，這兩個指標(biāo)通常是矛盾的，可根據(jù)需要來有所側(cè)重，一般來說，好的方法與步驟應(yīng)該是簡單易行，*終的酶制劑有較高的收率和純度。
在分離提純過程中，應(yīng)該盡量避免引起蛋白質(zhì)變性的各種因素，此外，在分離提純前，必須建立對酶的分析鑒定方法，以正確指導(dǎo)分離提純地進(jìn)行。
材料與方法
1 實(shí)驗(yàn)儀器
冰箱，低速離心機(jī)，電泳儀，722分光光度計，托盤天平，水浴堝，血糖管，透析袋，水平電泳槽，微量加樣器，離心管，三角瓶，玻璃棒，滴管，燒杯，移液管，量筒，試管等。
2 實(shí)驗(yàn)試劑
乙酸鈉，甲苯，蒸餾水，10%乙酸,95%乙醇,0.2%Glc,溶液，3,5二硝基水楊酸試劑�？捡R斯亮藍(lán)G-250，牛血清白蛋白，2M NaOH,0.1M蔗糖。
3 試驗(yàn)方法
3.1葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：
取11支編號的試管按下表的順序加入0.2%Glc，水及3,5-二硝基水楊酸試劑。然后在沸水浴中加熱5分鐘，然后立即用自來水冷卻，轉(zhuǎn)移至血糖管中并用蒸餾水定容至25ml，搖勻，于540nm測光密度，結(jié)果如下表所示：
管號        含糖量（ug）
BG濃度        0.2%Glc
標(biāo)準(zhǔn)液（ml）        水（ml）        3，5-二硝基
水楊酸試劑（ml）        OD540nm
1        0.0        0.0        2.0        1.5        0.0
2        0.4        0.2        1.8        1.5        0.062
3        0.8        0.4        1.6        1.5        0.137
4        1.2        0.6        1.4        1.5        0.223
5        1.6        0.8        1.2        1.5        0.300
6        2.0        1.0        1.0        1.5        0.385
7        2.4        1.2        0.8        1.5        0.468
8        2.8        1.4        0.6        1.5        0.509
9        3.2        1.6        0.4        1.5        0.597
10        3.6        1.8        0.2        1.5        0.675
11        4.0        2.0        0.0        1.5        0.753
3.2標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的制作
取11支編號的試管，分別準(zhǔn)確加入如下表所示的牛血清白蛋白溶液，然后分別加入1.5ml考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白染色試劑，搖勻，放置3min后，在595nm比色讀取OD值，結(jié)果如下表所示：
管號        標(biāo)注蛋白濃度（ug/ml）        牛血清蛋白標(biāo)
準(zhǔn)液（ml）        水（ml）        考馬斯亮藍(lán)G-250
蛋白染色試劑（ml）        OD595
0        0        0        1.0        1.5        0
1        20        0.1        0.9        1.5        0.025
2        40        0.2        0.8        1.5        0.066
3        60        0.3        0.7        1.5        0.243
4        80        0.4        0.6        1.5        0.368
5        100        0.5        0.5        1.5        0.468
6        120        0.6        0.4        1.5        0.530
7        140        0.7        0.3        1.5        0.650
8        160        0.8        0.2        1.5        0.699
9        180        0.9        0.1        1.5        0.823
10        200        1.0        0.0        1.5        0.947
3.3轉(zhuǎn)化酶的純化
3.3.1粗品的制備和乙醇分級沉淀
3.3.1.1自溶
用臺秤稱取40g的新鮮啤酒酵母放在250毫升三角瓶中，再分別放入1.2克乙酸鈉細(xì)粉末、20毫升甲苯。然后在35℃水浴中間隔片刻震蕩、保溫30分鐘，此時會觀察到菌體自溶現(xiàn)象。
3.3.3.2抽提及粗酶的制備
往上述自溶液中加入60毫升水，于35℃保溫過夜。第二天，將自溶液于4000RPM*15min離心。取出離心管后分三層：下層透明，中間為蛋白層，上層為有機(jī)層。用吸液管將*上層的甲苯吸去，然后可再用一藥勺擋住塊狀粘稠物，傾斜離心管倒出上清液。棄去粘稠物。此時會有一些懸浮物存在。再離心一次（4000RPM*20min），如上清液已濾清，小心倒入250毫升燒杯中。得到的溶液就是無細(xì)胞抽提液即粗酶液。
量出粗酶液的體積VE1=42ml，從中取出1毫升置0—4℃保存，將待測酶活力和蛋白濃度。
3.3.3.3乙醇分級沉淀
先用10%的乙酸調(diào)粗酶液pH在4.4—4.6之間，記錄加入10%乙酸的體積。
⑴ 32%乙醇飽和度
按下列的公式算出使粗酶液的乙醇濃度達(dá)到32%時所需乙醇體積。
X1/V+X1=0.32
其中V=44ml，需要加入95%的乙醇體積：X/0.95=22ml
注意：在滴加乙醇時滴與滴之間不能連成線 。
滴加結(jié)束后，于4000RPM*5min。上清轉(zhuǎn)移到另一燒杯中待用，棄去沉淀。
⑵47.5%的乙醇飽和度
按下式算出使酶液乙醇濃度達(dá)到47.5%時所需乙醇的量。
X2/V=X2=0.475
需要加入95%的乙醇體積X2/0.95=44ml
按下式算出使酶液乙醇濃度達(dá)到47.5%所需補(bǔ)加的乙醇的體積。
X2/0.95-X1/0.95=22ml
然后靜置10min，于4000RPM*10min，棄去上清會得少量沉淀。將沉淀用10ml，pH6.0，0.005MPBS溶解（10mlPBS應(yīng)分2-3次充分溶解），裝入自制的透析袋中，并作一標(biāo)記，將透析袋放入盛有pH6.0，0.005MPBS的燒杯中進(jìn)行透析，時間為2-3小時（中間要換一次透析液，并置冰箱中進(jìn)行透析）。透析后將透析酶液離心，4000RPM*5min，取上清，量體積即為E2并留1ml（0-4℃保存）待測酶活力及蛋白濃度，其余酶液上DEAE-Cellulose柱。
3.3.2次純化
3.3.2.1裝柱
本實(shí)驗(yàn)使用的層析柱的規(guī)格是1.5cm（內(nèi)徑）*20cm（高）。把柱子垂直固定好。將DEAE-Cellulose裝柱，床高距柱頂2cm為宜。用起始緩沖液（pH6.0,0.005M PBS），平衡流速成4ml/5min。
3.4.2.2柱的平衡
裝好柱后，用起始緩沖液（pH6.0,0.005M PBS），平衡流速成4ml/5min。目的是交換劑上的平衡離子全部變成起始緩沖液的相應(yīng)離子。另一方面，在流洗柱的過程中，也可以使交換劑床緊密，從而提高分離效果。平衡洗柱的流出體積至少應(yīng)是床體積的5倍左右。
3.3.2.3上樣
將柱中多余液體放出后，將2ml樣品小心加到層析柱中，打開流速夾，使樣品液流入柱內(nèi)。然后加pH6.0,0.005M PBS150ml洗柱。此流出液理論上應(yīng)不含我們所需要的酶，因此可不必收集，但必須檢查是否有酶活力存在。
3.3.2.4洗脫
待150ml PBS洗完后，改換含0.1M NaCl的pH6.0,0.005M PBS洗脫（此處洗下來的是我們所需的酶），流速為0.6-0.8ml/min，每管收集5ml，收集5-7管后，改換含0.2 M NaCl的pH6.0,0.005M PBS洗脫，收集至經(jīng)檢查無酶活力為止。
3.3.2.5酶活力的檢測
取試管若干支，編號，各加入2ml5%蔗糖（pH4.6）每間隔一管取0.05ml收集液，按先后順序分別加入上述含2ml5%蔗糖的試管中混勻，置35℃水浴10min仍以先后順序加入0.5ml 1M NaOH,立即搖勻，加入1.5ml3，5—二硝基水楊酸，于沸水浴中煮沸5min，用自來水冷卻，轉(zhuǎn)移至血糖管中，用蒸餾水稀釋至25ml，塞好，搖勻。直接目測，即可確定活力高峰范圍。合并活力高峰酶液，量體積，即得E3，從中取出1毫升置0—4℃保存，將待測酶活力和蛋白濃度。將其余的酶液裝入透析袋中，作一標(biāo)記用pH6.0,0.005M PBS透析3小時（置冰箱），然后用聚乙二醇6000（PEG）將酶液濃縮至1—1.5ml，供下步用。
3.3.3第二次純化：分子篩層析
3.3.3.1裝柱
取已經(jīng)與處理好的G-150適量，裝入自制的1*25cm的層析柱中，用pH6.0,0.005M PBS平衡，流速1ml/5min,流出液體積大約為柱床體積5倍左右視為平衡好。
3.5.2上樣
與一般柱層析相同，將柱中多余液體放出后，將樣品小心加到凝膠柱上，打開流速夾，使樣品流入柱內(nèi)。然后加pH6.0,0.005M PBS150ml洗脫，檢測酶活力，確定活力高峰位置，收集活力高峰范圍內(nèi)的酶液，量體積，即為E4。留1ml于4℃保存作為 測定蛋白質(zhì)濃度和酶活力用。其余用于電泳法檢測酶純度和測定米氏常數(shù)Km用。
3.4轉(zhuǎn)化酶活力及蛋白質(zhì)濃度的測定
1活力測定
酶液稀釋：將E1﹑E2﹑E3﹑E4依次稀釋40﹑160﹑400﹑400倍；
2反應(yīng)：取4支試管分別加入2ml稀釋的酶液（每個樣品平行作3份），一個空白對照加0.5 ml1 M NaOH，搖勻，使酶失活；另3支為測定管。再分別加入2ml5%的蔗糖，并準(zhǔn)確計時10min，分別加入0.5 ml1 M NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。從反映混合液中取出0.5 ml于血糖管中，加1.5ml3，5—二硝基水楊酸和1.5ml蒸餾水，混勻，于沸水浴中加熱5 min，定容至25ml搖勻，在540nm下測定吸光度。
3.5蔗糖酶米氏常數(shù)—Km的測定
3.5.1取11支試管，編號，按下表將蔗糖液，乙酸緩沖液分別加入各管中；
3.5.2于各管依次間隔2min加入酶液2ml，記時，立即搖勻，于室溫下靜置10min；
3.5.3按同樣順序和時間間隔加入0.5 ml1 M NaOH，搖勻終止反應(yīng)；
3.5.4吸取反應(yīng)液0.5ml，加入已含有3,5-二硝基水楊酸和1.5ml蒸餾水的試管中搖勻，于沸水浴加熱5min，冷卻后于血糖管中定容至25ml，搖勻，在540nm測定值OD。Km的測定：


管號        0.1M蔗糖（ml）        乙酸緩沖液（ml）        酶液（ml）        2M NaOH（ml）        吸取反應(yīng)液（ml）        3，5-二硝基水楊酸 （ml）        蒸餾水（ml）        [S]        1/[S]
（1/M）        1/V
（1/OD）
1        0        2.00        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0                0
2        0.20        1.80        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.005        200        5.464
3        0.25        1.75        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.000625        160        4.367
4        0.30        1.70        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0075        133.8        3.571
5        0.35        1.65        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.00875        114.8        3.247
6        0.40        1.60        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5                100        2.701
7        0.50        1.50        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0125        80        2.222
8        0.60        1.40        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.015        66.7        1.992
9        0.80        1.20        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.02        50        1.484
10        1.00        1.00        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.025        40        1.238
11        1.50        0.50        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0375        26.7        1.045

結(jié)果與分析
4.1根據(jù)圖表的數(shù)據(jù)可以得到下面的曲線，根據(jù)本曲線為后面酶活力的測定提供參考。得到公式y(tǒng)=0.1895x-0.0054

4.2根據(jù)得到的蛋白曲線得到如下公式：y=0.0049x-0.0529

4.4在540nm下測定吸光度結(jié)果如下:
酶        OD540        平均值
E1*40        0.623        0.679        0.720        0.674
E2*160        0.528                        0.528
E3*400        0.269        0.518（舍掉）        0.271        0.270
E4*400        0.293        0.234        0.299        0.275
在測定的時候，由于E2的量不足，因此沒能完成3組的測定，由于數(shù)據(jù)比較單調(diào)，因此對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性比較低；測定E3時，第二組數(shù)據(jù)與另外兩個出入很明顯，可能是操作中酶液量取不準(zhǔn)確或者試管洗刷不徹底，因此舍棄這個數(shù)據(jù)。
在595nm的吸光度結(jié)果如下
酶        OD595
E*40        0.522
E*40        0.240
E*4        0.380
E*5        0.135

跟去上圖得到公式:y=0.0258+0.0229
橫軸截距=-1/Km
得到Km=0.1127，而Km的理論值是25~28mM，所得結(jié)果明顯大于理論值，估計主要原因可能是提取過程中由于沒有嚴(yán)格在低溫下操作和在離心時由于多個小組連續(xù)使用離心機(jī)，使得離心機(jī)的溫度升高等多種原因，導(dǎo)致酶活降低。
4.5數(shù)據(jù)處理與分析
步驟        樣品總體積（ml）        酶活力（u/ml）        總活力（u）        蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）        總蛋白質(zhì)量（mg）        比活力（u/mgPr）        提純倍數(shù)（fold）        階段收率（%）        總收率（%）
E1        42        358.5        15057        4410        185220        0.08129        1        100        100
E2        7.5        1126        8445        2400        18000        0.4692        10        56        56
E3        5        1452        7260        352        1760        4.125        105        86        48
E4        1.7        1482.5        2520        143        242        10.36        765        35        17
我們經(jīng)過多步操作提取到了達(dá)到較高純度的蔗糖酶。由于實(shí)驗(yàn)步驟較復(fù)雜，且不是連續(xù)操作，而是中間有很多間斷等多種因素的影響，以致所得數(shù)據(jù)不太理想。由于本實(shí)驗(yàn)的銜接性比較強(qiáng)，隨著實(shí)驗(yàn)的深入，試驗(yàn)的偏差就愈來愈明顯，因而后面數(shù)據(jù)較難取舍，只能得出十分粗糙的結(jié)論，因而可信度也隨之降低。其中E1，E2是試驗(yàn)的初始步驟，相對可信度比較高；另外盡管E3，E4蛋白濃度差別比較大，但酶活力基本相同，酶活力沒有上升，沒有達(dá)到預(yù)期的目的。酶的總收率達(dá)17%，基本達(dá)到預(yù)期目的。另外，由于時間倉促和操作水平的限制，本實(shí)驗(yàn)也有許多不足之處需要改進(jìn)。
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