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一、流式細胞術發(fā)展簡史

　　流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的新型分析技術和分選技術。其特點是：①測量速度快，*快可在1秒種內計測數萬個細胞；②可進行多參數測量，可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數測量，并具有明顯的統(tǒng)計學意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等從多領域的知識和成果；④既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。

　　概要說來，流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計數技術，以及數據的采集和分析技術等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個世紀以來人們在這方面的心血和成果。

　　1934年，Moldavan₁首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數，并用光電記錄裝置計測的設想，在此之前，人們還習慣于測量靜止的細胞，因為要使單個細胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細胞和細胞團塊的淤阻。1953年Crosland –Taylor根據雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的研究認識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體動力聚集作用。于是設計了一個流動室，使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現代流式細胞術中的液流技術基礎。

　　1956年，Coulter在多年研究的基礎上利用Coulter效應生產了Coulter 計數器。其基本原理是：使細胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質之間存在著導電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強度和個數則可獲得有關細胞大小和數目方面的信息。1967年Holm等設計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細胞，再由光電檢測設備計數的裝置。1973年Steinkamp設計了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標記的細胞，既能分析計數，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現代FCM計數技術的主要歷程。

　　現代的FCM數據采集和分析技術是從組織化學發(fā)源的，其開拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在組織化學的基礎上提出了兩個新設想：（1）細胞的組分是可以用光光度學來定量測定的，即分光光度術可以定量地獲得有關細胞組織化學的重要信息。（2）細胞的不同組分可以同時進行多參數測量，從而可以對細胞進行分類。換句話說，對同一細胞可以同時獲得有關不同組分的多方面信息，用作鑒別細胞的依據。Kamentsky不僅思路敏捷，而且能身體力行。他是個把計算機接口接到儀器上并記錄分析了多參數數據的人，也是個采用了二維直方圖來顯示和分析多參數的人。

　　流式細胞術在細胞化學中的應用的先驅者是Van Dilla和美國的Los Alamos小組。他們在1967年研制出流液束、照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細胞計的基礎上，首次用熒光Feulgen反應對DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細胞周期的各個時相。Gohde 和Dittrich接著把這項技術推向實用，他們用流式細胞術測定細胞周期借以研究細胞藥代動力學問題。FCM用于免疫組織化學中的關鍵是對細胞進行免疫熒光染色，其它和在細胞化學的應用并沒有多大差異。

　　近20年來，國內外在FCM上都做了不少的研究和應用工作，也取得了不少成果。特別是隨著儀器和方法和日臻完善，人們越來越致力于樣品制備、細胞標記、軟件開發(fā)等方面的工作以擴大FCM的應用領域和使用效果。FCM在免疫組織化學中的應用也大致差不多，并注重了在臨床應用的推廣。

　　二、流式細胞計的基本結構和工作原理

　　流式細胞計是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特征參量，并可以根據預選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。多數流式細胞計是一種零分辨率的儀器，它只能測量一個細胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細節(jié)　分辨率為零。國外又把流式細胞計稱作熒光激活細胞分選器（Flu－orescence Activated Cell Sorter, FACS）。美國Becton—Dickinson 公司生產的流式細胞計系列均冠以FACS字頭。目前我國國內使用的儀器多為美國、西歐及日本等國的產品，國內有些單位也已研制成功，但尚無定型產品面市。

　　1．流式細胞計的基本結構流式細胞計主要由四部分組成。它們是：流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。圖10-1為其結構示意圖。

　�。�1）流動室和液流系統(tǒng)：流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設計和制作均很精細，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號可發(fā)生振動。

　�。�2）激光源和光學系統(tǒng)：經特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據被激發(fā)物質的激發(fā)光譜而定。汞燈是*常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線*強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以647nm較強。免疫學上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應需要即構成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續(xù)可調的激光，尤在590nm處轉換效率，約可占到一半。為使細胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細胞上的激光光斑直徑應和細胞直徑相近。因此需將激光光束經透鏡會聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來選擇激光的波長，調整反射鏡的角度使調諧到所需要的波長λ。為了進一步使檢測的發(fā)射熒光更強，并提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區(qū)段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。

　�。�3）光電管和檢測系統(tǒng)：經熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。光電倍增管（PMT）*為常用。PMT的響應時間短，僅為ns數量級；光譜響應特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產額都比較高。光電倍增管的增益從10³到10⁸可連續(xù)調節(jié)　，因此對弱光測量十分有利。光電管運行時特別要注意穩(wěn)定性問題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因為光譜響應特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強光下穩(wěn)定性比PMT好。

　　從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內變化的信號以及代表生物學線性過程的信號，例DNA測量等。另一類是對數放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數關系。在免疫學測量中常使用對數放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽性三個亞群，它們的熒光強度相差1～2個數量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數放大器采集數據易于解釋。此外還有調節(jié)　便利、細胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點。

　�。�4）計算機和分析系統(tǒng)：經放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數是和電信號的脈沖高度相對應的，也是和光信號的強弱相關的。對應道數年縱坐標通常代表發(fā)出該信號的細胞相對數目。多道分析器出來的信號再經模-數轉換器輸往微機處理器編成數據文件，或存貯于計算機的硬盤和軟盤上，或存于儀器內以備調用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的6～8個參數。存貯于計算機內的數據可以在實測后脫機重現，進行數據處理和分析，*后給出結果。除上述四個主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。

　　2．流式細胞計的工作原理下面分別簡要介紹流式細胞計有關的參數測量、樣品分選及數據處理等工作原理。

　　（1）參數測量原理：流式細胞計可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由于光學性質的改變，其散射光信號當然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。

　　在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0^。角）散射（FSC）；②側向散射（SSC），又稱90^。角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經實驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線性關系；對于形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。

　　在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量*有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

　　熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對于結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。

　　減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學系統(tǒng)；③采用電子補償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。

　�。�2）樣品分選原理：流式細胞計的分選功能是由細胞分選器來完成的�？偟倪^程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據選定的某個參數由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉，落入收集器中；其它液體被當作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。

　　穩(wěn)定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數百μm。實驗經驗公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉是由充電電路和偏轉板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉板間的電位差為數千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數測定經邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數十ms。精確測定延遲時間是決定分選質量的關鍵，儀器多采用移位寄存器數字電路來產生延遲�？筛鶕�具體要求予以適當調整。

　�。�50）數據處理原理：FCM的數據處理主要包括數據的顯示和分析，至于對儀器給出的結果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。

　�、贁祿�顯示：FCM的數據顯示方式包括單參數直方圖（histogram）、二維點圖（dot plot）、二維等高圖（contour ）、假三維圖（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。

　　直方圖是一維數據用昨*多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據選擇放大器類型不同，橫座標可以是線性標度或對數標度，用“道數”（Channel No .）來表示,實質上是所測的熒光或散射光的強度�？v座標一般表示的是細胞的相對數。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個參數與細胞之間的關系是它的局限性。

　　二維點圖能夠顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系。橫座標和縱座標分別為與細胞有關的兩個獨立參數，平面上每一個點表示同時具有相應座標植的細胞存在（圖10-3）�？梢杂啥�維點圖得到兩個一維直方圖，但是由于兼并現象存在，二維點圖的信息量要大于二個一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個細胞具有相同的二維座標在圖上只表現為一個點，這樣對細胞點密集的地方就難于顯示它的精細結構。

　　二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。曲線層次越高所代表的細胞數愈多。一般層次所表示的細胞數間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。

　　假三維圖是利用計算機技術對二維等高圖的一種視覺直觀的表現方法。它把原二維圖中的隱座標—細胞數同時顯現，但參數維圖可以通過旋轉、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結構和細節(jié)　，這無疑是有助于對數據進行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。

　　列表模式其實只是多參數數據文件的一種計算機存貯方式，三個以上的參數數據顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的�？捎肔ist Mode中的特殊技術，開窗或用游標調出相關部分再改變維數進行顯示。例如，“一調二”就是在一維圖上調出二維圖來；“二調一”就是從二維圖中調出一維圖來。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調出相應窗口的直方圖的示意圖。

　　上面簡要地介紹了幾種數據顯示形式，在實際應用中，可根據需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。

　�、跀祿�分析：數據分析的方法總的可分為參數方法和非參數方法兩大類。當被檢測的生物學系統(tǒng)能夠用某種數學模型技術時則多使用參數方法。數學模型可以是一個方程或方程組，方程的參數產生所需要的信息來自所測的數據。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細胞頻數的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數來描述這些數據，則參數即為面積、平均值和標準偏差。方程的數據擬合則通常使用*小二乘法。而非參數分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設，即采用無設定參數分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數分布；也可能很復雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進行比較。

　　逐點描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統(tǒng)）是大家常用的數據分析的重要手段。我們�？梢杂脕砹私鈹祿�的特性、尋找那些不曾預料的特異征兆、選擇統(tǒng)計分析的模型、顯示*終結果等。事實上，不經過先對數據進行直觀觀察分析就決不應該對這批數據進行數值分析。從這一點來看，非參數分析是參數分析的基礎。

　　逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現明顯的差異，特別是對照組和測試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設置應根據整體實驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進行比較時對曲線的總細胞數進行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到“差結果曲線”往往是適宜的。

　　因為數據分析往往和結果解釋關系十分密切，也就是說和生物學背景相關，因此具體的分析法和原理將在后面結合實例再介紹。

　　3．流式細胞計的技術參數　為了表征儀器性能，往往根據使用目的和要求而提出幾個技術參數或指標來定量說明。對于流式細胞計常用的技術指標有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測量參數等。

　　（1）熒光分辨率：強度一定的熒光在測量時是在一定道址上的一個正態(tài)分布的峰，熒光分辨率是指兩相鄰的峰可分辨的*小間隔。通常用變異系數（C.V值）來表示。C.V的定義式為：

　　C.V=σ/μ

　　式中，σ為標準偏差，μ是平均值。

　　在實際應用中，我們使用挖關系式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。目前儀器的熒光分辨率均優(yōu)于2.0%。

　�。�2）熒光靈敏度：反映儀器所能探測的*小熒光光強的大小。一般用熒光微球上所標可測出的FITC（fluorescein isothiocyanate 異硫氰基熒光素）的*少分子數來表示。目前儀器均可達到1000左右。

　�。�3）分析速度/分選速度：儀器每秒種可分析/分選的數目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。

　�。�4）樣品濃度：主要給出儀器工作時樣品濃度的適用范圍。一般在10^5～10⁷細胞/ml的數量級。

　　其它技術參數尚多，不再一一介紹。

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　　4．流式細胞計的調試和使用　古語說：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應用流式細胞分析和分選技術，必需先對儀器進行調試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡要介紹細胞計的調試項目及要點、使用的程序等等。

　　（1）調試和校準：流式細胞計在使用前，甚至在使用過程中都要精心進行調試，以保證工作的可靠性和*佳性。調試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區(qū)的光路等。

　　激光強度：除調整反射鏡的角度以調整到所需波長的激光出光外，還要結合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為。

　　液流速度：可通過操作臺數字顯示監(jiān)督，調節(jié)　氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。

　　測量區(qū)光路調節(jié)�。哼@是調試工作的關鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90^。散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點較小。一般可在用標準熒光微球等校準中完成。

　　流式細胞術中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進行校準或標定，這樣才能通過相對測量獲得絕對的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的準直調整和定量標度。標準樣品應該穩(wěn)定，有形成份形狀應是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經濟、容易獲得。常用標準熒光微球作為非生物學標準樣品，雞血紅細胞做為生物學標準樣品。微球用樹脂材料制作，或標有熒光素，或不標記熒光素。Flow Cytometry Stands公司可提供熒光強度藥盒，在免疫實驗中可用來作為定量熒光標準來測定每個細胞所標記的抗原位點數目。所用的雞血紅細胞標準樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4），經PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細胞混合，室溫下振蕩醛化24h，*后經PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。

　�。�2）儀器的操作和使用：

　�、俅蜷_電源，對系統(tǒng)進行預熱；

　�、诖蜷_氣體閾，調節(jié)　壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；

　�、墼跇悠饭苤屑尤肴ルx子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；

　�、芾�用校準標準樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的基礎上，0^。和90^。散射的熒光強度*強，并要求變異系數為*小；

　　⑤選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程；

　　⑥樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

　�、咭驗閷嶒灁祿�已存入計算機硬盤（有的機器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數據處理；

　　⑧將所需結果打印出來。

　　在操作和使用中一定要注意如下事項：　

　　1）光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強的光線下以后，需要較長時間的“暗適應”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；

　　2）光源不得在短時間內（一般要1h左右）關上又打開；使用光源必須預熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

　　3）液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經過過濾、消毒；

　　4）注意根據測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；

　　5）特別強度每次測量都需要對照組。

　　本節(jié)　著重介紹了流式細胞計的基本結構和工作原理、技術指標及使用操作中的基本問題。由于實際使用的儀器廠家、型號差別很大，不能一一介紹，可參照儀器使用說明書使用。至于流式細胞術在生物醫(yī)學工程和免疫組織化學應用中的一些具體技術途徑則在下節(jié)　詳細介紹。

第二節(jié)　FCM在生物醫(yī)學工程學方面的應用

　　流式細胞術在細胞生物學、分子遺傳學、微生物學、免疫學、分子生物學以及臨床腫瘤學、臨床血液學等諸多領域都有廣泛應用。本節(jié)　概要介紹它們的技術途徑及主要原理，大家可以從中看出它們是和細胞化學密切相關的。

　　一、FCM應用的技術途徑

　　FCM是通過測量細胞的多種參量來獲取信息的。細胞參數分為結構參量和功能參量兩大類。結構參量主要用于描述細胞的化學組分和形態(tài)特征；功能參量主要是描述細胞整體的理化和生物特性。這些參量有的需要經熒光標記方可測定，有的并不需要熒光標記。DNA以及RNA的含量，蛋白總含量、胞內pH值和細胞大小等為結構參數；細胞周期動力學、特殊配體的鑒定、特殊細胞的生物活性等則為功能參數。

　　1．DNA和RNA的測量和分析DNA和RNA的含量可以用多種熒光探針標記后測出。對細胞內DNA含量的測定可用于細胞生物學方面的研究和臨床腫瘤學的診斷；測量RNA的含量可用于血液中的網織紅細胞的檢測和計數；DNA和RNA含量的測定可以用于區(qū)別細胞周期中的G₀和G₁期。常用的熒光探針有吖啶橙（AO，Acridine·orange）、派洛寧Y（PY，Pyronine Y）、HO（Hoechst）系列和色霉素A₃（CA₃）等。利用HO/CA₃雙染色還可分析DNA的堿基組成。還可以結合Brdu （Bromodeoxyuridine, 溴脫氧尿嘧啶核苷）單克隆抗體免疫熒光來測定細胞內DNA合成。

　　2．蛋白質總量測定用FCM可以測定細胞中蛋白的總含量，以檢測一個細胞群體生長和代謝的狀態(tài)，或區(qū)別具有不同蛋白含量的細胞亞群，如血液中的白細胞的分類。檢測總蛋白的常用熒光探針為異硫氰基熒光素（FITC，Fluorescein isothiocyanate），FITC以共價鍵方式與蛋白上帶正電的殘基結合。

　　3．特殊配體的測定配體是與不同的細胞結構特異結合很強的各種大分子和小分子，通過對特異性的熒光標記的配體的測定可以獲得不少有關結構參量和功能參量的信息。例如用標記的外源凝集素可檢測細胞表面糖；用標記抗體可測表面抗原；用標記多聚陽離子可檢測細胞表面電荷；用標記的激素、生長因子、神經遞質和病毒等可檢測細胞受體；用標記的大分子、微生物等可檢測細胞的內吞性；用熒光素標記的親和素以及帶有DUTP的生物素衍生物的DNA探針跟靶細胞的DNA雜交能夠檢測原位的特殊基因等。這方面的應用范圍廣、有前途，已經成為研究細胞和組織中的抗原、基因和各種生化過程的強有力的新技術。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、若丹明系列（如四甲基異硫氰基若丹明TRITC、異硫氰基若丹明X-RITc 和美國德州紅等）、藻膽蛋白系列等。由于各種熒光探針具有不同的光譜特性，在使用中要注意正確地使用激光光源和濾片。

　　4．生物活性的測定就生物流行性來說，主要包括兩方面工作：①細胞本身的死活；②活細胞生物功能發(fā)揮的強弱。前項工作單一，后項工作要復雜得多。FCM用來判斷細胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細胞膜進入細胞內而發(fā)出熒光的物質；例如下醋酸酯熒光素（FDA，flourescein Diacetate）它可被活細胞持留而發(fā)出黃綠色熒光；若細胞有損傷則會從細胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細胞膜，但能對固定的細胞及膜有破損的細胞的核進行染色，例如碘化丙啶（PI,Propidium iodide）和溴化乙錠（EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二類熒光探針。

　　用FCM來測定活細胞生物功能發(fā)揮方面和性能的指標很多。例如可用來測細胞膜電位、細胞內pH值和細胞內鈣等，這些都和細胞的激活密切相關。FCM也可用來測膜結構的流動性或微粘度等。有報告可以用FCM代替⁵¹Cr的放射免疫分析來測定天然殺傷細胞（NK, Natu-ral killer cells）對靶細胞毒理學活性的大小。

　　二、FCM的典型應用簡介

　　下面簡單介紹FCM在各個領域中應用的典型實例，以求對FCM應用的全面了解，并能深入了解FCM在免疫細胞化學中應用的背景。

　　1．在細胞生物學方面的應用細胞生物學是FCM應用*廣泛也是*基本的領域，細胞周期分析是其基本分析內容，而實施的技術途徑是通過測定細胞周期各時相的DNA含量來達到的。

　　眾所周知，細胞周期由G₁期、S期、G₂期和M期所構成的。各期細胞的DNA含量如下：G₁期為2C，G₂期和M期為4C，S期則在2C到4C之間。所以在FCM的DNA直方圖上形成的譜線則為峰分布，而且G₁峰的道數恰好是G₂和M峰道數的一半（圖10-7）。研究表明：對于正常細胞群，各周期時相的細胞數的比例是同一的；對于惡性病變的細胞群則是非均一的（圖10-8）。

　　臨床腫瘤病學已經注意到細胞動力學的重要性。研究工作表明：腫瘤細胞對化療和放療的敏感程度與細胞的增生率高低密切相關；采取細胞同步化（Cell Synchronization）措施可以提高療效。例如可以使用雌激素這種外源性藥物讓雌激素受體陽性的乳腺癌細胞同步化。

　　臨床微生物學可以用FCM對大量細菌的DNA和RNA含量進行測量，進行微生物鑒定、醫(yī)學常規(guī)中的細菌抗生素敏感試驗和傳染活性的測定。

　　FCM優(yōu)良的分析和分選功能在分子遺傳學領域也能充分發(fā)揮。例如流式細胞核型分析技術就是用FCM對染色體進行分類、純化，檢測或定量測量細胞表面或內部由特異基本所編碼的成份。這方面的成果已用在畜類性別的預選擇，以及對人類計劃生育等方面的工作。

　　2．在免疫學方面的應用　FCM以它的快速、靈活及定量的特點被廣泛地應用于免疫學的基礎研究和臨床應用的各個方面，尤其是結合單克隆抗體技術，在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監(jiān)測、機體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現代免疫技術的重要組成部分�；�于免疫技術是免疫細胞化學分析技術的基礎，我們著重介紹FCM在免疫應用中的技術問題。

　�。�1）免疫應用的激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)：適用于免疫技術的FCM的激發(fā)光是氪離子氣體激光器，光譜中波長為531nm和856nm的譜線*強。為了擴大儀器對雙標記或三標記染色的熒光信號的分辨范圍可使用雙激光光源。

　　為了減少細胞由于激光束造成的散射光對光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統(tǒng)。為了同時測定兩種波長以上的熒光信號，光路中還要使用二向性分光元件。

　　為了測定伴隨細胞轉化過程所產生的早期免疫及生化性質的改變，例如膜的流行性，DNA構象變化等，可以使用偏振片。

　　總之，應用于免疫學時要充分考慮有關光源及光學濾片系統(tǒng)的正確使用。

　　（2）免疫應用的熒光染料及染色：免疫應用中的熒光染料主要有FITC（488nm）、TRITC（515nm）、PE（藻紅蛋白，575nm）及其組合。在進行多種標記時特別要注意結合抗體的每種色素都不干擾抗體反應的特異性，也不相互干擾。

　　免疫熒光染色有直接法和間接法二類：

　�、僦苯尤旧�法

　　1）取約10⁶的細胞置于尖底離心管內，管內液體要少些。加熒光標記抗體，在4℃溫度下靜置15～30min。若作雙標記染色也可直接加入。

　　2）用冷的10%的小牛血清、0.1%的疊氮鈉溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4）離心清洗細胞2次。1000rpm離心5min或4000rpm離心1min。

　　3）加入適量緩沖液待測。

　�、陂g接染色法：

　　1）取10⁶細胞加特異的抗體，4^℃溫度下靜置15～30min。

　　2）加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標記的第二抗體，4^℃靜置30　min。

　　3）緩沖液離心清洗2次后加入適量緩沖液待測。為減少無關因素干擾，操作盡量在水浴中進行。

　　染色中應注意的事項：①細胞標本在整個過程中要盡量保持新鮮，采用有效措施防止表面抗原消失和細胞死亡；②熒光標記物用前應用濾膜或高速離心去除顆�；虺猎�以減少非特異性干擾；③細胞標本染色前應除死細胞；④為提高靈敏度可用三步間接染色法。

　　（3）免疫熒光標本的特殊處理：

　�、偎兰毎�及碎片去除：樣品中不可避免地存在著死細胞及碎片，影響分析結果。對于血細胞可用FCM通過0^。散射的差異不經染色而將死細胞分出棄除；對于培養(yǎng)細胞，由于其大小分布不均，可在樣品內加少量PI染色后將死細胞去掉。一般情況下即可用儀器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用離法去除小碎片。

　�、跇吮镜谋４婧凸潭ǎ簩嶒炛写蠖鄶禈悠吩谌旧�或分析前需要保存一定的時間，有時甚至需要進行固定。

　　未染色的新鮮標本貯存方法如下：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×10^6～1×10⁷細胞在-70^℃過夜，然后置液氮中可長期保存。

　　免疫染色未經固定的標本在4^℃可保存48h。若需存放時間較長、或標本具有傳染性，應該用固定劑固定。常用的固定劑配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理鹽水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：將經免疫熒光染色的細胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4^℃溫度保存。一般來說，經固定處理的標本保存1周至2個月，多數樣品的陽性細胞群體比例及熒光強度增色能保持在正常范圍之內。

　　（4）主要檢測的免疫指標：

　�、偌毎�毒試驗：細胞毒是機體的一種免疫監(jiān)督機制，細胞毒實驗是一項重要的免疫指標。例如天然殺傷細胞NK（Natural killer）是一種引起免疫媒介的效應物，在抗腫瘤及感染因子的免疫監(jiān)督系統(tǒng)中起著重要作用。研究表明，對NK細胞的測量可以做為免疫治療監(jiān)測的重要參數和有效的預后征狀的指標。所使用的熒光探針為CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate）。

　�、谕淌晒δ軐嶒灒簡魏送淌杉毎�系統(tǒng)是機體的主要防御系統(tǒng)。FCM可以快速、定量地檢查吞噬細胞的吞噬能力和速度。

　�、跧型變變態(tài)反應的IgE受體細胞、IgE結合因子的檢查。

　　④胞漿Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG測定，等等。

　　3．在臨床方面的應用FCM在臨床診斷、療效評價和預后預測等方面都發(fā)揮了一定的作用。工作做得較多的主要在腫瘤學、血液病學等。這些都和FCM在熒光細胞化學中的直接應用有關。

　�。�1）癌前病變的檢測和預后評價：有效地發(fā)現癌前病變而給予阻斷治療，無疑是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié)　。FCM的探測對象主要是癌前細胞，即那些處于正常細胞向癌細胞轉化的量變階段、尚未達到質變的細胞。研究表明，除心肌、肝組織及精子細胞外，人類正常的體細胞都具有恒定的DNA二倍體含量，而那些癌前細胞和癌細胞則在其發(fā)生發(fā)展過程中伴有DNA含量變化異常。另在資料表明：癌前病變向癌變的轉化發(fā)生率與細胞的不典型增生程度有關，而細胞的不典型增生程度又與DNA含量的異常改變呈平行關系。利用FCM可以定量地測出癌前細胞的DNA含量并根據DNA分布直方圖直觀地反映出細胞的周期分布狀態(tài)，從而了解到癌前細胞增殖能力變化的動態(tài)過程，這樣便可以獲得一些從組織形態(tài)學中難以得到的信息。

　　表10-1 是以胃粘膜為例比較正常細胞和胃癌細胞在DNA含量及細胞周期分布方面的差異。

表10-1　正常與胃癌的胃粘膜細胞DNA含量方面的差異

　　從表中看出差異是顯著的。我國一些學者也提出有關FCM診斷癌腫細胞的細胞標準，并已付之臨床應用。

　　目前，對于癌癥病人預后評估的主要依據是病理組織學分級和臨床分期等指標，不少人已認識到用FCM來檢測DNA是對腫瘤預后評價的一個較為客觀有效的指標�？偟膬A向是：異倍體的出現是惡性腫瘤的一個標志；異倍體腫瘤的惡性程度高、復發(fā)率高、轉移率高及死亡率高；二倍體及近二倍體腫瘤預后較好。

　　在臨床血液學方面的應用目前也以血液系統(tǒng)的腫瘤診斷、分型和預后關系等方面的應用為主；其主要技術途徑也是基于對DNA倍體分析和細胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多敘。有關的技術細節(jié)　將在下節(jié)　以FCM在外周血白細胞的免疫組織化學分析方面的應用為例詳加介紹。

　�。�2）DNA指數：由于DNA的非整倍體細胞是腫瘤的特異性標志已經得到腫瘤學界的公認，在些學者提出建議采用流式細胞術DNA分級指數（Flow cytometry DNA Crading Index, 簡稱DNA指數或DI）表示DNA含量的異常程度。根據1984年分析細胞學會名詞審定委員會的規(guī)定：

　　一般樣品應采用同種或同個體的正常細胞為標準二倍體細胞。在血液學研究中通常以正常人外周血淋巴細胞作為標準二倍體細胞。需要指出的是，在報告DNA的測定結果時必需包括G₀/G₁峰的變異和系數，即C.V值，若有多個DNA干系則要給出各個G₀/G₁峰的C.V值。用于腫瘤臨床診斷的總體依據是：a.正常二倍體的DI=1.0，判斷為陰性；b.出現二個或多個可以分辨的G₀/G₁峰則可判斷為陽性；c.雖無明顯的G₀/G₁峰的分化現象，但峰的C.V值較大，則可根據DI數個及其它有鑒別意義的征狀給出參考性的診斷。

　　以上我們主要從FCM在生物醫(yī)學工程學領域應用的基本原理和技術途徑介紹了和組織化學有關的內容，至于一些技術細節(jié)　則在下節(jié)　做較為詳細的說明。

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第三節(jié)　FCM對外周白細胞的免疫熒光分析

　　外周血是臨床檢驗中的重要標本。FCM分析外周白細胞的主要目的是了解各種白細胞的數目與分群情況。這些數字的變化與臨床的某些疾病有一定的關系。近年來，由于多種識別白細胞膜表面抗原的單克隆抗體的發(fā)現，以及對這些單克隆抗體的直接或間接熒光標記物的出現，使得利用FCM的熒光組織化學分析獲得被測細胞的多指標的更多、更準確的信息，這無疑對警覺臨床和科研有很大幫助。本節(jié)　主要討論有關外周血的白細胞的免疫熒光標記技術、數據分析及臨床應用等方面的問題。

　　一、白細胞的免疫熒光標記技術

　　1．白細胞抗原下面給出世界衛(wèi)生組織對白細胞抗原的統(tǒng)一命名，以及它們的分子量、對應的單克隆抗體及反應陽性的細胞（見表10-2）。

表10-2　WHO對白細胞分化抗原的命名

　　a：急性淋巴細胞性白血��；b：慢性淋巴細胞性白血病。

　　2．樣品的制備供FCM分析的樣品是單細胞懸液，而且大部分樣品都需經熒光染色。樣品的制備方法大致有三種：①用熒光單克隆抗體染全血，隨后溶解紅細胞；②紅細胞溶解后染色；③通過梯度離心法分離出單個淋巴細胞和單核細胞，再將之制成細胞懸液染色。

　�。�1）全血染色后溶解紅細胞：由于不少血液標本具有生物危害性，用此方法可以將染色、溶解、固定、分析幾個步驟都在一個試管內進行，這樣減少轉換過程中的污染。而且此法比用梯度離心分離出單個核細胞更節(jié)　省時間。由于此法未將粒細胞去除，故在用FCM分析時，要注意排除粒細胞的干擾。

　　具體操作步驟如下：

　�、偃�血100～150μl，放入5ml試管，并用50～100μl PBS稀釋，總體積為200μl。]

　�、跓晒鈽擞浀膯慰寺】贵w染色30min，4^℃（或放于冰上）。單克隆抗體的濃度因不同來源差異很大，但為了使用方便，可按其說明書配成每次實驗使用10μl。注意蔽光。

　�、塾�3～4μl冷BPS清洗。離心250×g（約每分鐘1500轉），5min，洗3次。注意每次用吸管將上清吸出，決不能傾倒去液！

　�、苡�2ml氯化銨液（配法見下）在室溫下溶解紅血球，約10min。若紅細胞完全被溶解，溶液由混濁變到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解過分，則導致白細胞上抗原被破壞，或者某些敏感的細胞死亡而導致比例的改變。若溶解不徹底，大量紅細胞會影響對淋巴細胞的分析。這是因為淋巴細胞在分析圖像上與紅細胞群接近，在框出淋巴細胞群時，會把部分紅細胞框定于淋巴細胞內。而紅細胞溶解不足或過度在很大程度上影響著分析結果。

　　【氯化銨液的配制】

　　Tris—氯化銨1×氯化銨

　　0.16mol/L 　NH₄Cl 　　0.38g/100ml　 　90ml 　　0.16mol/L　　NH₄Cl

　　0.17mol/L 　Tris 　　2.06g/100ml 　　10ml　　0.17mol/l 　　Tris

　　pH值7.56 　　　　　　　　　　　　　　　　pH值7.2

　�、菁t細胞被徹底溶解，加入1ml PBS稀釋的0.5%甲醛，立即離心，洗3次，條件同步驟③。加入甲醛的目的是盡早固定細胞和細胞上的抗原，避免有生物危害的標本到處污染。

　　⑥將染色完成的細胞懸浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液內。置4^℃，蔽光，等待分析。經固定后的細胞在冰箱內可保存一周，這樣對工作的安排會帶來方便。

　　（2）紅細胞被溶解后再對白細胞染色：此方法的優(yōu)點是可以了解被染白細胞的數量以及存活率。但由于有時有些標本比較敏感，溶解紅細胞后，還要經過多個染色步驟，這樣容易造成抗原的喪失。此法具體步驟如下：

　�、偈覝叵路湃�14ml氯化銨在15ml的試管里。

　�、诩尤�0.5～1ml全血，混合3～5min。

　�、哿⒓措x心100～150×g，并用PBS洗2次。

　�、馨准毎�計數，注意存活率應在90%以上。做成每毫升含5×10⁶白細胞懸浮液。將細胞分配到5ml的試管，每試管0.2ml，即1×10⁶個細胞。

　�、轃晒鈽擞浀膯慰寺】贵w染色30min，4^℃，避光�？贵w濃度配制如前所述。

　　⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

　�。�3）用Ficoll—Hypaque 梯度離心法分離出單個核細胞：用此法可以分離骨髓細胞、淋巴結、扁桃體搗碎后的單細胞懸液等。血液標本應有抗凝劑。取血到分離不能超過6h。

　　①抗凝全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀釋。

　　②稀釋血8或40ml置于15或50ml離心管內，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分離液，比重為1.007）從離心管底部輕輕加入到血的下面。這種方法對血的擾動較小，比將全血加到Ficoll上面為好。加完后，可以清楚看到Ficoll與全血之間有一明顯的分界線。注意在Ficoll快加完時應特別小心，否則有可能加入氣泡攪混血樣，使血與分離液混合，達不到分離的目的。

　�、垭x心350～400g,30min。紅細胞、粒細胞以及死細胞將位于離心管底部，中間層的單個核細胞為淋巴細胞、單核細胞和一些血小板。

　�、苋〕鲋虚g層中所有細胞，若在Ficoll中還有細胞也要取出，這也是單個核細胞（PBMC）。

　�、萦肞BS洗3次，第1次清洗時，可用較快速400×g離心10min。因為有可能中間層中混有一些ficoll，比重增加而細胞不易沉降。

　　⑥PBMC計數，注意存活率應高于90%。配成5×10⁶個/ml的細胞懸浮液。

　�、呷〕�0.2ml的懸浮液加入到5ml試管（內含1×10⁶細胞），用熒光標記的單克隆抗體染色，方法如前。洗3次后固定。注意必須先染色后固定，固定后的細胞膜通透性改變，會導致熒光標記的抗體進入細胞中去，而在顯微鏡下觀察的染色效果則和死細胞一樣。當用FCM分析時，則均為陽性而達不到檢驗目的。這也是用FCM分析的細胞存活率應高于90%的原因。

　�。�4）熒光標記抗體的細胞染色：如前所述，FCM分析被熒光標記的抗體染色的細胞，在選擇熒光染料時必須注意這些熒光染料所需要的激發(fā)光波長是否與所使用的FCM的激發(fā)光譜相匹配。一般各個公司所采用的綠色熒光染料為FITC，而選用的紅色熒光染料卻不盡相同，有的用TRITC，有的用藻紅蛋白（PE），所需要的激發(fā)光譜就不一樣，因而若因匹配不當則會招致熒光抗體所染的細胞分析不出來，這是應該注意的。

　　這里的標本染色方法和免疫熒光法相同。下面僅說明一些具體的注意事項：

　�、僭谟瞄g接法染色時，染色步驟依次為抗體→清洗→第二抗體→清洗→紅細胞溶解。為了實驗的方便，將第二抗體也配成每次實驗用10μl。

　�、陔p色法：雙色法多用于直接染色法。將分別用FITC和PE標記的抗體各10μl置入同一個含有約1×10⁶/0.2ml的試管內，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

　　目前不少制備單克隆抗體的公司已將比值有意義的兩種抗體，分別用紅、綠熒光染料標記后，制成一種試劑。如CD₂—FITC/CD₂₀—PE；CD₄-FITC/CD₈-PE等。可按說明使用，具體用量為每次實驗10μl。

　　③對照組：眾所周知，免疫組化的染色過程中，陰性和陽性對照是必不可少的。在準備用FCM分析的細胞時，對照標本的制備顯得格外重要。因為一次用FCM分析的樣品可能會很多，甚至多達上百個試管。對同一病人也可能會用到20～30個不同的單克隆抗體。每一個病人都要有相應的陰性對照。陰性對照主要用于儀器分析細胞之前，設立陰性和陽性的分界線。陽性對照主要用于檢查染色方法。陽性對照細胞選自那些已知的細胞和已知的單克隆抗體中的陽性反應*明顯者。陰性對照細胞有以下幾種：

　　1）非染色細胞：直接染色法時，用10μl PBS代替與熒光結合的單克隆抗體，其它步驟相同。間接染色法時，分別用10μl的PBS代替抗體和熒光第二抗體，其它步驟相同。

　　2）使用非特異性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg），代替特異性的單克隆抗體。這是由于所使用的單克隆抗體來自小鼠，可能造成非特異性的假性反應，因此使用MsIg作為對照。同時還需要注意選擇與實驗用單克隆抗體亞類一致的MsIg。如大部分單克隆抗體為IgG1，也有部分抗體為IgM，所以用MsIg作對照組時，往往使用MsIgG和MsIgM兩種。直接染色法時，用10μl與熒光結合的MsIg，代替熒光單克隆抗體。間接染色時，用10μl無熒光的MsIg代替抗體。其它步驟與實驗組相同。

　　3）雙染色對照：將各10μl 的分別與紅熒光染料和綠熒光染料結合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一個試管，代替熒光的特異性單克隆抗體，其它步驟相同。

　　4）間接法對照：用10μl的PBS代替抗體。熒光第二抗體的濃度和使用量均與其它實驗相同，其它實驗步驟也和實驗組相同。

　　二、白細胞免疫熒光分析的數據分析

　　在儀器調試和校準及標本制備完畢之后，就要做測試和數據分析工作。這里先討論一下有關數據測量和分析的技術問題，而一些醫(yī)學應用的具體參數的測量和分析后面做介紹。

　　1.0^。散射和90^。散射的雙指標的二維圖像分析　　可以把0^。和90^。散射分別選作二維圖像的X軸和Y軸指標。通過圖中數據點分布把全血分為淋巴細胞、單核細胞和粒細胞幾個亞群（圖10-9）。

　　圖中，A、B圖的淋巴細胞數大約有6000～9000個；C、D圖約有2000～4000個。分群編號依次表示：①紅細胞、死細胞和渣滓；②淋巴細胞群；③大顆粒淋巴細胞；④單核細胞；⑤粒細胞。數據是對1000個細胞分析得到的。

　　若用單指標直方圖，對PBMC而言，可以把淋巴細胞和單核細胞分開。見圖10-10中的A、B圖。但對紅細胞溶解后的全血，單指標圖分辨率則不夠了（圖10-10的C、D圖），圖A、B給出的是經ficoll后的PBMC；圖C、D給出的是人外周血白細胞。圖中數字編號所代表的組分和圖10-9相同。

　　由上可見，在分析紅細胞溶解后的全血時，必須先采用雙指標二維點圖。從圖上也可清楚地看出，粒細胞、未被溶解的紅細胞和一些渣滓，由于不同的體積和致密度，明顯地區(qū)別于淋巴細胞和單核細胞從而能把它們分開。看到清楚的細胞分群以后，可以在計算機的顯示屏上將所要分析的細胞畫線框出，并通過指令送入存貯器，以后就可只對框出部分做各種數據分析和深入考查。圖10-11就是對雙指標點圖上的淋巴細胞群框定的示意圖。數字所表示的意思和圖10-9相同。

　　2．單維直方圖上陰性分界游標設置前面已經強調，在用FCM分析時，陰性對照是必不可少的。首先用非染色細胞，根據前面介紹的雙指標二維點圖的辦法，將某一細胞群框定；然后分別選用綠色熒光（GFL）和紅色熒光（RFL）單指標直方圖。在直方圖上所出現的細胞均為陽性�？捎酶淖僄FL和RFL增益的辦法，將細胞恰好調節(jié)　到左側并設立游標（圖10-12）。

然后再測試MsIg染色的陰性對照。某些細胞，由于膜上的Fc受體可以與對照抗體鼠Ig非特異性結合，因而有一定的背景染色，不過這種陽性百分率不應超過5%。所以MsIg與非染色細胞的分界游標確立后，以后所測試的標本以此為標準，游標位置基本不變。

　　MsIg的紅、綠熒光陰陽性分界游標確立以后，可以測試實驗標本。首先檢查細胞分群情況，然后檢查淋巴細胞群是否落在已輸入計算機的淋巴細胞框定的范圍里。若染色及FCM的工作性能都正常，則框定的位置不會改變。然后轉換成熒光直方圖。若為FITC標記的細胞，則GFL為X軸；若為PE標記的細胞，則用RFL為X軸。由于陰陽性分界游標記已確立，細胞陽性率及圖像均顯示于計算機熒光屏上；同時也可選用其它指標和圖像、打印所需的資料等。

　　3．雙染色分析游標設立和熒光校正

　�。�1）游標的設立：游標設立的原理和單染并無不同，但具體要用二維點圖和二維等高圖來完成。分別選用GFL和RFL為X和Y軸。先用不染色細胞測試，將陰性細胞集中在左下角（圖10-13）。分別為X、Y軸設立游標，再用MsIg的陰性對照測試�？蓪�X、Y軸游標略為移動，使位于窗“3”內的細胞（陰性）在95%以上。

　�。�2）紅、綠熒光的校正：由于紅色熒光探測器在*佳測試狀態(tài)時，會讓部分綠色熒光進入紅色熒光探測器。這是因為一部分細胞發(fā)出的綠色熒光波長較長。若用阻斷或濾色的辦法消除進入紅熒光探測器的這部分GRL，就會大大地降低RFL探測器的靈敏度。因而只好在操作時，通過電子計算機預入熒光校正，在RFL中適當扣除GRL的影響。

　　通常紅色熒光進入綠色熒光探測器的情況比較光見，圖10-14給出CD₁₁-PE（T細胞、RFL）及CD₈-FITC（T抑制細胞，GFL）雙染細胞在二維等高圖上進行熒光校正的示意圖。X軸為GFL，Y軸為RFL，由X軸Y軸游標劃分的四個窗的陰陽性和圖10-13相同。各窗給出的百分數為該細胞群所占百分比。圖A表示未經校正時的情形。窗“2”內31.46%表示雙陽性細胞，即在T細胞中31.46%為抑制細胞毒細胞。經過適當校正，可見有兩群陽性雙標記細胞出現（B圖）。高強度部分為真正的CD₈、CD₁₁雙標記陽性細胞；低強度部分屬于CD₈綠色陽性細胞（NK細胞）。此時“2”窗中細胞份額減為7.59%。需要指出的是校正過度則會使各區(qū)的陽性細胞都減少（圖C）。

1區(qū)：紅色熒光陽性；2區(qū)�。杭t、綠熒光均為陽性；3區(qū)：陰性細胞：4區(qū)：綠色熒光陽性細胞

　　雙染色的熒光校正是用電子補償電路來完成的。補償時先測定一種染料的熒光，此時除了應該接收該熒光的光電倍增管PMT₁有信號輸出外，另一光電倍增管PMT₂也常會有微弱輸出。調節(jié)　補償器使PMT₂的輸出為0；然后再測另一種波長的熒光染料，調PMT_１的補償器使之輸出也為0；然后再測另一種波長的熒光的染料，調PMT₁的補償器使之輸出也為0：如此反復調節(jié)　，使兩種熒光的探測器都獲得補償。實際調節(jié)　時用的是一種標準熒光微球，微球上標有已知數量的熒光分子。利用不同的微球可調整、補償不同熒光的測量通道。需要指出的是：當PMT高壓有所改變、激光和濾片系統(tǒng)有所變動時，都要對熒光校正做重新補償調節(jié)　。

　　三、淋巴細胞亞群的測定及其在臨床醫(yī)學中的實用意義

　　淋巴細胞由于表面特異性抗原的差異可分為四大類（表10-3），這些不同抗原表現型的亞群執(zhí)行不同的機能。而且某些疾病會選擇性地損傷某些亞群而造成亞群之間的比例失調。根據FCM雙熒光分析的結果，現將不同的抗原和不同的機能的淋巴細胞亞群列于表10-4。

表10-13 主要淋巴細胞亞群的表面抗原

　　＋：表現的抗原；－：未表現的抗原；＋／－：主要亞群有表現的抗原；－／＋：抗原僅表現于少數亞群。

表10－14　淋巴細胞機能性亞群

　　外周血白細胞的機能，特別是淋巴細胞的機能狀態(tài)在一定程度上反應了機體的免疫機能。近幾年來，用FCM來測定某些疾病的淋巴細胞及其亞群已成為重要的診斷和預后判斷的指標，如對骨髓、器官移植，白血病、淋巴瘤的診斷和對免疫缺陷病的估價等。測定淋巴細胞亞群的主要依據是在于淋巴細胞表面不同的抗原表現型，而這些表現型又依賴于相應的單克隆抗體而被識別。所以，特異性很高的單克隆抗體結合的FCM，已為臨床提供了不少非常有用而重要的資料，但被FCM所分析的淋巴細胞的整個臨床意義尚未完全認識清楚。隨著更多確定淋巴細胞表現型的試劑的應用，FCM對診斷和治療計劃的擬定以及預后的估計將會表現出更重要的實用意義。

　　1．T淋巴細胞亞群的測定如前所述，在使用FCM分析時，先用0^。散射和90^。光散射雙指標將白細胞分為三群：淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。在二維點圖上劃出淋巴細胞群范圍后，設立GFL的RFL單指標的直方圖。命電子計算機僅計數所輸入的淋巴細胞，即劃線框出的那部分細胞。一般計數輸入的細胞可設1000～5000個。直方圖的分析可顯示陽性細胞的百分率。應用輸入細胞數、陽性細胞百分數以及白細胞分類計數，就能得到陽性細胞的絕對值，即每立方毫米血液中的絕對值。有時T淋巴細胞某亞群的絕對值比百分率更為重要，因為它可以表明T細胞某亞群的增高和減少。當然，淋巴細胞占白細胞的百分數也是一個重要數據，應當準確測出。

　　CD₄/CD₈細胞的比值，有時也用于反映病人淋巴系統(tǒng)的機能狀態(tài)。不少臨床免疫實驗室已把CD₄/CD₈的值作為常規(guī)血檢查的項目。在上，淋巴細胞亞群以及CD₄/CD₈并未建立統(tǒng)一數值，各實驗室均需建立自己的標準。平均值一般為1.73～2.00。

　　一般而言，影響淋巴細胞亞群的因素較多，如年齡、性別、種族、以及外周圍環(huán)境如季節(jié)　、藥品等的影響。T細胞的絕對值在兒童略高于成人。嬰兒CD₄細胞的百分率較成年人高；老年人的CD₈略低。正常人在一晝夜內也有周期性的波動：上午CD₄略低，下午4時之后開始增加，直至次晨，平均波動為15%～20%。盡管正常情況下淋巴細胞亞群有所變動，但仍屬正常范圍。某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴細胞腫瘤，其淋巴細胞亞群及其比值測量結果均可能偏離正常范圍。

　　有工作報道，傳統(tǒng)的T輔助誘導細胞（CD₄⁺）具有抑制機能，而在T抑制細胞毒細胞（CD₄⁺）中，有些又具有協助的功能。因此，對原來設想的CD₄、CD₈的機能分群有所混淆。預計會有新的單克隆抗體再從CD₄和CD₈的細胞中分出。不過就目前看來，不少臨床免疫實驗室已用CD₄/CD₈比值結合淋巴細胞絕對值對多種疾病的診斷、治療和預后的估計提供了不少有價值的資料。

　　2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病是一種由人類T淋巴細胞病毒（HLTV－－III）感染而造成的疾病。這種病毒主要侵襲CD₄⁺T細胞，而導致CD₄淋巴細胞減少，CD₄/CD₈淋巴細胞比值下降，甚至可低到0.5以下。艾滋病多發(fā)生在同性戀性行為活躍的男性，這可能與多次重復感染HLTV-III有關。對異性性行為活躍的人來講，對HLTV—IIi 感染的機會也不容忽視。另一種感染的途徑是HLTV血清陽性的獻血者對受血者的感染。有部分人血液中T淋巴細胞減少，CD₄/CD₈比值下降，但HTLV血清反應不一定就是陽性。有些人CD₄減少不明顯，但CD₈有所增加，也會導致CD₄/CD₈的的比值下降。

　　對可疑為艾滋病及血清檢驗為陽性的人，T細胞亞群是分析了解免疫系統(tǒng)被病毒破壞程度的標志。初診時，CD₄細胞越少，CD₄/CD₈值越低者，預后越差。所以經治療后恢復的指標則是CD₄細胞數增加，CD₄/CD₈比值升高。用熒光標記雙染色的FCM分析的結果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改變外，同時還可以表現出OKT₁₀陽性細胞增多（圖10-15）。病人表現為CD₈和OKT₁₀同時增加時，預后比OKT₁₀陽性細胞低的病情嚴重。

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺細胞均減少，而Leu₂⁺、Leu₈^-細胞相應增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺與Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺細胞明顯增加

　　3．白血病和淋巴瘤的表現型　近年來，為了弄清這些腫瘤的病理組織形態(tài)、影響治療效果的原因與免疫狀態(tài)的相互關系，對于不同類型的白血病和淋巴瘤作為廣泛的細胞表面表現型的研究。

　　在診斷方面，FCM與單克隆抗體結合，可以弄清這些腫瘤的免疫起源，特別是分清B細胞性、T細胞性或骨髓性腫瘤。同時，還可以證實一些與細胞起源相關的抗原，如普通急性淋巴細胞性白血病抗原（CALLA、CD₁₀）。另外，可以用適當的試劑從反應免疫過程中來證實單克隆的腫瘤細胞的增殖。

　　大部分淋巴系統(tǒng)腫瘤均起源于B細胞。而B細胞腫瘤常用抗免疫球蛋白的抗體來證實。由于前B細胞與漿細胞表面均無免疫蛋白，所以用檢測免疫球蛋白的辦法就只能證實B細胞發(fā)育中間時期的腫瘤。目前，已有一系列的B細胞表面抗原被發(fā)現，而可以證實B細胞個體發(fā)育的各個時期的腫瘤。

　　對B細胞腫瘤*有價值的抗原是CALLA。這種抗原僅存在于B細胞正常以育期的前B細胞、早期B細胞以及80%～90%的急性淋巴細胞性白血病。因此，抗CALLA抗體可以區(qū)別淋巴細胞性和髓性白血病。用抗CALLA結合其它一些成熟B細胞的單克隆抗體，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄（B₄，B₁，BA_-1）將能證實大部分B細胞來源的腫瘤。圖10-16給出了B細胞分化的各個時期細胞膜的表現型。來源于B細胞的腫瘤和正常B細胞的表現型相似，也就是說，B細胞前身、成熟B細胞及*后分化為分泌B細胞—漿細胞。

　　由于T淋巴細胞來源的腫瘤浸潤性較強，預后較差，并需要多種治療。T細胞腫瘤的表現型千變萬化，但大部分均表現T細胞抗原CD₇（Leu₉,3A）或其它T細胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁）。這些抗原與腫瘤的細胞成熟時間有關，因而有助于擬定治療方案。從FCM分析的結果表明，非成熟的T細胞腫瘤常表現非成熟的T細胞抗原，如CD₁和t ₁₀。而成熟的T 細胞腫瘤則僅表現成熟T細胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有時也可表現CD₂、CD₈，但不會出現在同一個細胞上面。

　　由于腫瘤細胞的多種來源，很難避免在腫瘤標本中混雜正常細胞，這給FCM的分析帶來技術上的困難。如殘留的紅細胞在FCM分析時，落入淋巴細胞框定的范圍內而造成淋巴細胞各種亞群百分率下降。所以在制備標本時，應盡量想法去除紅細胞。另一種污染是正常細胞存在于腫瘤細胞之間，這是一個很頭痛的問題。例如骨髓常被外周血污染，反應性的正常淋巴細胞滲入到腫瘤組織中等，因此估計污染程度對解釋FCM分析的資料有一定的意義。因為在FCM分析時，正常細胞與腫瘤細胞可能由于不同的體積和密度而被分開，根據對污染的估計，仔細分析圖像就能得到比較正確的結果。

　　4．FCM對正常B細胞和B細胞腫瘤分析　　FCM對正常B細胞和B細胞腫瘤的分析在免疫學研究和臨床診斷上有著重要的實用價值，B細胞的某些特征必須使用FCM來分析，但是這在FCM技術方法中仍存在著一些需要解決的問題。

　�。�1）B細胞的標記：B細胞膜表現免疫球蛋白（SIg）存在于所有成熟B細胞。*早的B細胞前身，細胞質內含有免疫球蛋白M（IgM），但不存在于細胞膜表面。細胞質內IgM的證實以及同時測定細胞表面的SIg，對FCM是很困難的，當然今后可能會用雙染法來解決這樣的難題。大部分成熟B細胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，當然這也可能是因為不同的亞群的緣故。但僅以Ig的重鏈來分類B細胞是不可靠的，因為B細胞可以從膜表面的IgM逐漸轉變成IgG，因而從重鏈著手無法把B細胞分類。大部分B細胞腫瘤也表現出帶有SIgM和SigD。隨著B細胞逐漸轉變成漿細胞，膜表面Ig 逐漸喪失，在細胞質內又出現大量的免疫球蛋白。

　　與重鏈相反，B細胞的整個發(fā)生期只有一種k或者λ輕鏈，B細胞腫瘤克隆僅表現一種輕鏈，因此通過在FCM上顯示的不平衡的輕鏈表現可以確定B細胞腫瘤。測定方法見（3）。

　　用SIg的缺點是它的“嗜細胞性”，因為正常B細胞、自然殺傷細胞（NK）、激活T細胞以及所有巨噬細胞均有Fc段受體，因而可以不同程度地與抗SIg單克隆抗體的Fc段結合而產生非特異性的結果，因此選擇抗體時，應使用已被胃蛋白酶消化過的、Fc段也被去除的、僅留下來的F（ab’）₂。

　�。�2）FCM測定B細胞的臨床指證：

　�、倜庖呷毕�；免疫缺陷可以是先天性或獲得性的。低丙種球蛋白白血癥和無丙種球蛋白白血癥常伴有免疫球蛋白分泌的紊亂，因此有必要分析B細胞。

　�、诹馨土觯悍呛谓芙鹗喜〉牧馨筒�，80%來源于B細胞。因而一旦懷疑為淋巴瘤，就應仔細用FCM對B細胞的表現型進行分析，可以分析血、骨髓、以及活檢淋巴結等。首先確定腫瘤細胞的來源：B細胞性（CD₂₀⁺，SIg⁺）或T細胞性（CD₃⁺）。也有可能某些淋巴病來源于單核細胞（CD₁₁⁺）成裸細胞而表現出非T非B。一旦確立為B細胞來源后，就應更進一步分析克隆增殖的性質：單克隆、少克隆、或是多克降珠。單克隆性的增殖往往是腫瘤的標志�？梢杂肧Ig的輕鏈和重鏈分別加以測試，往往輕鏈比重鏈更有價值。在不久的將來，或許可以直接用免疫球蛋白的基本加以鑒別。

　　對B細胞亞群的確定，目前并未定論，但某些B細胞被CD₅（T₁，OKT₁）染色。正常B細胞中這些細胞較少，而多見于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷時期。在B細胞的腫瘤病人中，10%的也可以出現CD₂₀（B₁）陰性反應，這是B細胞成熟而將分化為漿細胞的標志。在異常B細胞上，往往有一些B細胞的標記缺失或其它表現型出現，因而對異常B細胞的FCM的分析尤為重要。圖10-17顯示CD₁₉—FITc （B細胞）和CD₅-PE（T細胞）雙染色的假三維圖像分析。X軸為綠色熒光的Leu₁₂（B細胞），Y軸為紅色熒光的PE—Leu₁（T細胞）。從圖中可見，有較多的細胞表現出Leu₁₂⁺t Leu₁⁺,陰性區(qū)內為NK細胞和紅細胞等。

　�。�3）k-λ測定B細胞克隆：k、λ測定法是一種從正常B細胞中測定少量B細胞克隆生長的方法。其基本原理是：若有B細胞克隆存在，將改變某一種輕鏈（k或λ）的熒光強度的分布。若輕鏈為k的B細胞生長，則抗k的抗體能測試出這種變化，而抗λ的抗體的測試沒有任何改變。正常情況下，B細胞的k和λ的熒光強度分布是一致的（見圖10-18）。

正常情況，B細胞輕鏈分布圖像，一致κ和λ的波形沒有區(qū)別。但在異常時，若有單克隆生長，κ鏈有分布則與λ不一致，在總和的曲線形態(tài)上也會產生差異。

　　在實際應用中，血液、體液、組織細胞的懸浮液效果均較好，而對于骨髓，大量細胞的非特異性標記會影響測定的結果。這里面必須強調，正常B細胞中的克隆細胞生長并不意味著它們必然是腫瘤細胞，還必須結合其它指標再做結論。不過這種方法對確定腫瘤細胞的存在、細胞發(fā)育階段、以及經治療后病情控制的狀況等，都可以提供一些有用的資料。

　　以上僅限于從外周血的白細胞分析這一側面介紹了FCM的某些疾病中的臨床應用。其實，它也僅只是問題的一個部分。例如，有研究工作表明：CD₃₄抗原在由紅系、巨核系、粒系和巨噬細胞三個細胞成株單元組成的成株細胞中有所表現。CD₃₄⁺細胞在人的骨髓細胞中約占1～4%，而在外周血中卻探測不到。又如，NK細胞近來被認為可能和人類的某些疾病的發(fā)病機理有關，對NK細胞的測量可以作為免疫治療的免疫監(jiān)測的重要參數和有效的預后征狀的指示。以前是用放射性的⁵¹Cr的釋放來檢測NK敏感的靶細胞的毒理學活性從而評估NK的功能的，而采用熒光探針CFDA（car－boxy—fluorescein diacetate）標記則可用FCM技術更為安全可靠地進行測定。有報告指出，健康男人的數值為（67.1±22.7%）%，健康女人為（63.9±20.0%）；患有婦科癌腫病人則為（38.5±23.1）%,明顯偏低。這些工作表明，FCM的技術從免疫組織化學角度還會有所發(fā)展。在第二節(jié)　我們曾簡單介紹了流式細胞分析技術在生物醫(yī)學工程中應用的一些技術途徑，這也可以啟發(fā)我們借助于FCM來提高免疫組織化學的分析能力。可以預見，FCM一定會成為免疫組織化學的一項重要的技術工具，并將在醫(yī)學科研和臨床應用中發(fā)揮更大的作用。

　　附【美國Becton –Dickinson 公司可提供的FCM標準】熒光微球（Fluorescent beads）；雞紅細胞核（Chicken erythrocyte nu－clei）和小牛胸腺細胞核（Calf thymocyte nuclei），用于DNA測量的質量控制；單克隆抗體試劑；以及用于免疫表型（immunopheno－typing）和其它臨床應用的藥盒。

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