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RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟

閱讀次數(shù)：1416   發(fā)布時(shí)間：2012/9/19 8:33:45

 

一、組織抽提：
1.       取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末
2.       移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿
3.       移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打
4.       冰上孵育5分鐘
5.       離心12,000g 4℃ 5分鐘取上清液移入1.5ml新離心管
6.       加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘
7.       離心<12,000g 4℃ 10分鐘取上層液相移入1.5ml新離心管
8.       加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘
9.       離心<12,000g 4℃ 5分鐘棄去上清液
10.   加入1 ml 75%乙醇，震蕩
11.   離心<7,500g 4℃ 5分鐘棄去上清液
12.   室溫下使之變透明
13.   加入DEPC處理水10μl －－35μl 溶解RNA（可保存在液氮或低溫冰箱）
14.   走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計(jì)檢測260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度
 
 
 
 
二、RT反應(yīng)體系（步）：約20分鐘

RNA    抽提物
5μl
Radome引物
2μl
RNA sin
0.5μl

1.       65℃ 15分鐘
2.       立即放入冰浴
RT反應(yīng)體系（第二步）：約2小時(shí)

RNA sin
0.5μl
10mM  dNTP
1μl
5×RT 緩沖液
4μl
25mM MgCl2
4μl
AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶
3μl

1.       37℃ 1.5小時(shí)
2.       94℃ 5-10分鐘
3.       反應(yīng)物保存于-20℃或進(jìn)行PCR
三1、PCR反應(yīng)體系：約4.5小時(shí)

25mM MgCl2
2μl
10×PCR 緩沖液
5μl
10mM  dNTP
1μl
上下游引物10pmol/μl
2.5μl×2
CDNA模板
2.5μl
ddH2O
34μl
Taq酶
0.5μl
輕質(zhì)石蠟油
50μl
 
100μl

1.       94℃ 2分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘為個(gè)步1個(gè)循環(huán)
2.       94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分鐘為第二步30個(gè)循環(huán)
3.       72℃ 10分鐘
4.       取出后4℃ 5分鐘后-20℃保存或走電泳
三2、PCR反應(yīng)體系：約5小時(shí)

25mM MgCl2
3μl
10×PCR 緩沖液
5μl
10mM  dNTP
1μl
上下游引物10pmol/μl
2.5μl×2
CDNA模板
5μl
ddH2O
30μl
Taq酶
1μl
輕質(zhì)石蠟油
50μl
 
100μl

1.       94℃ 2分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘為個(gè)步1個(gè)循環(huán)
2.       94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分鐘為第二步40個(gè)循環(huán)
3.       72℃ 10分鐘
4.       取出后4℃ 5分鐘后-20℃保存或走電泳
四、電泳：約1.25小時(shí)
1.       配0.5×TBE電泳緩沖液300 ml
2.       膠濃度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g膠）
3.       微波爐中火2分鐘溶解膠
4.       冷卻至60℃加入溴乙錠2μl（10mg/ml的終濃度0.5μg/ml）
5.       放入梳子，澆板，待凝固
6.       加8μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物+2μl溴酚蘭
7.       電泳50-80V（每㎝ 5V）

 

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